Revista de Gastroenterología de México Revista de Gastroenterología de México
Rev Gastroenterol Mex. 2011;76:309-15 - Vol. 76 Núm.04

Síndrome de intestino irritable: frecuencia y relación filogenética de Blastocystis sp. de pacientes mexicanos

ME Ramírez-Mirandaa, DE Jiménez-Gonzáleza, ME Rodríguez-Campaa, A González-Anguloa, R Hernández-Castellanosa, A Sara Arroyo-Escalantea, M Romero-Valdovinosa, F Martínez-Hernándeza, A Flisserb, P Maravillaa

a Hospital General Dr. Manuel Gea González, México, D. F.
b Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México, México D. F.

Palabras clave

Síndrome de intestino irritable, parásitos, Blastocystis sp., México.

Resumen

Introducción: Estudios recientes basados en la frecuente presencia de Blastocystis sp. en pacientes con síndrome de intestino irritable (SII), han permitido proponer a este parásito como posible responsable del SII. El papel patógeno de Blastocystis aún es controversial, ya que se le identifica en personas asintomáticas y aparentemente saludables. La blastocistosis en México ha sido poco estudiada. Objetivo: Identificar la presencia de Blastocystis sp. en pacientes con SII, utilizando técnicas de biología molecular y describir su relación filogenética con secuencias de otros países. Métodos: Se reclutaron pacientes con SII con base en los criterios de Roma III. En todos los participantes se realizaron colonoscopias, análisis coproparasitoscópicos, coprocult ivo y escrutinio para la detección de Rotavirus/Adenovirus. La identificación Blastocystis sp se realizó por PCR y secuenciación. Resultados: Se estudiaron 11 hombres y 51 mujeres con una media de edad de 45.6 ± 15.7 años. EL 86% de los pacientes tuvo una colonoscopia normal, 8% presentaron pólipos y 6% enfermedad diverticular. Blastocystis sp. fue identificado en 25% de los participantes (todos con colonoscopia normal) y solo dos pacientes tuvieron Endolimax nana y Entamoeba histolytica/E. dispar respectivamente. El análisis filogenético mostró que la mayoría de las secuencias mexicanas se agruparon en un clúster junto con secuencias de Japón y de Dinamarca. Asimismo, dos secuencias de nuestros pacientes con SII se ubicaron en otro clúster cercano. Conclusiones: Blastocystis sp. fue identificado en 25% de los pacientes con SII. Nuestros datos apoyan la hipótesis de linajes clonales de este parásito en el mundo.

Artículo

¿ Introducción

El síndrome de intestino irritable (SII) es una enfermedad funcional gastrointestinal que se caracteriza clínicamente por la asociación de dolor, molestia abdominal o ambos, así como alteraciones en el hábito de las deposiciones fecales.1,2 El SII se presenta entre 10% y 20% de los adultos y adolecentes de todo el mundo.1-3 En México, la prevalencia del SII varía de 16% a 35.5% con un intervalo de edad que va de los 15 a los 40 años.4-6

Aunque la fisiopatología del SII permanece incierta, algunas publicaciones consideran que la gastroenteritis infecciosa es un factor determinante para desarrollar esta enfermedad,7 al igual que el posible papel de los polimorfismos en los promotores de las citocinas proinflamatorias, ya que se encontraron ciertos polimorfismos genéticos de las interleucinas IL-4, IL-6, IL-10 y TNF-α asociados al desarrollo del SII.8-10 Otros estudios han asociado la presencia de algunos parásitos al SII, entre los que destaca Blastocystis sp.11,12 que es un microorganismo de distribución mundial cuya prevalencia en países desarrollados de Europa o como Estados Unidos es de 10%, mientras que en países en vías de desarrollo puede ser mayor de 80%.13-16 En México, la información que se tiene sobre este parásito es limitada. Estudios coprológicos en niños residentes de zonas urbanas mostraron una prevalencia de Blastocystis de 3% a 7%,17,18 mientras que un estudio de factores de riesgo realizado en comerciantes de alimentos de mercados establecidos en la delegación de Xochimilco, México D. F., mostró una prevalencia de 42% y una asociación estadística con el sexo masculino, con hábitos deficientes en higiene personal, antecedentes de parasitosis previas y de tener un familiar que hubiese estado parasitado.19 Tres estudios desarrollados en niños de comunidades rurales y suburbanas del Estado de Guerrero (México) mostraron frecuencias de 61% a 81% para Blastocystis.20,21 Se ha documentado que los estudios coproparasitoscópicos (CPS), t radicionalmente utilizados para el diagnóstico de Blastocystis sp., poseen una sensibilidad del 50% a 82%.13 Recientemente se describió la técnica molecular de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico de Blastocystis sp., la cual tiene una especificidad de 100% y fue capaz de detectar desde 32 parásitos en 200 mg de heces.22 Debido al polimorfismo genético de este parásito, continúa debatiéndose su estatus taxonómico, por lo que se recomienda que se le refiera solo por su género, como Blastocystis sp. o simplemente como Blastocystis.23

¿ Objetivo

Identificar la presencia de Blastocystis sp. en pacientes con SII, utilizando técnicas de biología molecular y describir su relación filogenética con secuencias de otros países.

¿ Métodos

Pacientes: Previa autorización de las Comisiones de Ética y de Investigación del Hospital General Dr. Manuel Gea González, se llevó a cabo el estudio de febrero de 2008 a enero de 2010, en el servicio de Gastroenterología de la Consulta Externa, en el que se invitó a participar a hombres y mujeres, mayores de 18 años, que presentaran SII. El diagnóstico de SII se hizo con base en los criterios de Roma III, los cuales establecen la presencia de malestar o dolor abdominal al menos tres días por mes, en los últimos tres meses presentando dos de las siguientes características: A) alivio con la defecación; B) cambio en la frecuencia de las deposiciones; C) cambio en la consistencia o forma de las heces.2 Los pacientes interesados en participar aceptaron firmar una carta de consentimiento informado y se sometieron a un estudio colonoscópico para eliminar la presencia de pólipos y otras alteraciones estructurales que pudieran ser responsables de la sintomatología referente. Se excluyeron a mujeres embarazadas, con historia clínica o con síntomas sugerentes de diabetes mellitus tipo I y II, colitis ulcerativa crónica inespecífica, enfermedad de Crohn, hemorroides, sangrado rectal y pacientes con alteraciones psiquiátricas evidentes. Se eliminaron aquellos pacientes cuyas muestras fecales no fueron adecuadas para el análisis molecular o aquellos participantes que no hubieran aceptado realizarse los estudios colonoscópicos o manifestaran su deseo de ser dados de baja del presente estudio.

Análisis microbiológico y molecular: Durante el estudio colonoscópico, se tomó una muestra de aspirado de material colónico (heces líquidas) de aproximadamente 10 mL en una trampa de plástico estéril, la cual fue llevada al laboratorio clínico para su procesamiento inmediato. Las muestras del aspirado se procesaron para la identificación de bacterias patógenas usando el sistema MicroScan system (Siemens, Reino Unido) y la búsqueda rápida de Rotavirus/Adenovirus (VIKIA, Rota-Adeno, BioMérieux, France). También se llevaron a cabo estudios coproparasitoscópicos mediante la técnica de Faust para la búsqueda de otros parásitos. Una alícuota del aspirado de aproximadamente 1.5 mL se conservó en congelación a -20oC para su posterior análisis molecular e identificación de Blastocystis sp. por PCR.

La extracción de DNA fecal total se llevó a cabo en los primeros siete días después de la toma de cada aspirado de heces. Para ello, se utilizó el sistema comercial PuregeneTM DNA purification system cell and tissue kit (Gentra Systems; Alemania). Las extracciones se realizaron de acuerdo a las especificaciones del proveedor. El diagnóstico molecular de Blastocystis se llevó a cabo por medio de un PCR utilizando los oligonucleótidos específicos diseñados por Stensvold y colaboradores,22 los cuales amplifican un fragmento de 310 pares de bases (pb) de la subunidad pequeña del RNA ribosomal (SSUrDNA) de Blastocystis sp. Los productos amplificados fueron visualizados en electroforesis horizontal en geles de agarosa a 1.5% y purificados para ser analizados posteriormente mediante su secuenciación por un proveedor comercial.

Análisis estadístico: Se calculó un tamaño de muestra de 62 participantes, utilizando el programa Primer of Biostatistics,24 considerando que es un estudio descriptivo para determinar la prevalencia de un evento en salud, con una frecuencia esperada de 80% de portadores de Blastocystis, 95% de potencia de prueba y un error de 10%. Se utilizó estadística descriptiva expresada en porcentaje, media y desviación estándar (DE). El análisis filogenético se construyó a partir de un algoritmo de Neighbor-joining (agrupamiento de secuencias más cercanas), realizado con el programa Mega versión 4.0.25 Para este análisis, también se incluyeron secuencias de Blastocystis sp. de portadores mexicanos sin SII (controles), así como de 43 secuencias de la SSUrDNA de Blastocystis, obtenidas del GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) de otras partes del mundo, cuyos números de acceso y origen se muestran en la Tabla 1. Como grupo externo se utilizó una secuencia de Proteromonas.

¿ Tabla 1. Número de acceso del GenBank de 43 secuencias de la SSUrDNA de Blastocystis usadas en la reconstrucción filogenética y país de origen del aislamiento.

¿ Resultados

Se incorporaron 62 pacientes con SII: 11 hombres y 51 mujeres cuya media de edad fue 45.6 ± 15.7 años. El estudio colonoscópico reveló que cinco (8%) presentaron pólipos, cuatro (6%) tuvieron enfermedad diverticular y los 56 restantes (86%) tuvieron resultados en parámetros normales. Respecto a los subtipos clínicos del SII,2 se identificó que el más frecuente fue el asociado a estreñimiento (64%), seguido de diarrea (24%) y el mixto (12%).

Las muestras del aspirado para la identificación de bacterias mostraron que Escherichia coli fue la bacteria más frecuente, seguida de Klebsiella pneumaniae y Proteus sp; sin embargo, se identificó un caso con Salmonella paratyphi A. La búsqueda rápida de Rotavirus/Adenovirus no detectó ningún caso con estas infecciones. Los estudios coproparasitoscópicos mediante la técnica de Faust mostraron un portador con Entamoeba histolytica/E. dispar y a otro con Endolimax nana.

El análisis de PCR mostró que 16 (25%) fueron portadores de Blastocystis. Todos los portadores de Blastocystis presentaron colonoscopias normales. En la Figura 1 se resumen los hallazgos microbiológicos de los 62 pacientes. En todas las muestras positivas por PCR para Blastocystis sp. se obtuvo una banda única de 310 pares de bases (Figura 2). El análisis filogenético mostró la formación de siete conglomerados o clústeres, en los que la mayoría de las secuencias mexicanas, se concentraron en un clúster, el cual también integró a parásitos de Japón, Dinamarca y algunas secuencias cuyo origen no fue documentado, con las cuales hubo una identidad ~97%. Solo dos secuencias de pacientes con SII se congregaron en otro clúster cercano, el cual no agrupó secuencias de otros países. El resto de las secuencias se agruparon en los otros cinco clústeres (Figura 3).

¿ Figura 1. Frecuencia de los microorganismos identificados en los pacientes con SII. De izquierda a derecha se muestran primero los parásitos identificados, seguidos de las bacterias.

¿ Figura 1. Frecuencia de los microorganismos identificados en los pacientes con SII. De izquierda a derecha se muestran primero los parásitos identificados, seguidos de las bacterias.

¿ Figura 2. Negativo de un gel de agarosa a 1.5%, teñido con bromuro de etidio y visualizado con luz UV. En el primer carril se observan los pesos moleculares de 100 pares de bases (pb) cada uno. La flecha muestra los amplicones diagnósticos de Blastocystis sp. de 310 pb en los distintos carriles del gel.

¿ Figura 2. Negativo de un gel de agarosa a 1.5%, teñido con bromuro de etidio y visualizado con luz UV. En el primer carril se observan los pesos moleculares de 100 pares de bases (pb) cada uno. La flecha muestra los amplicones diagnósticos de Blastocystis sp. de 310 pb en los distintos carriles del gel.

¿ Figura 3. Árbol filogenético construido con un algoritmo de Neighbor-joining, con secuencias de Blastocystis sp. de pacientes mexicanos con SII (síndrome) y sin SII (controles) y de otras partes del mundo. Se identifican siete clústeres en colores: en azul se observa la mayoría de las secuencias mexicanas y en rosa dos secuencias de pacientes mexicanos con SII.

¿ Figura 3. Árbol filogenético construido con un algoritmo de Neighbor-joining, con secuencias de Blastocystis sp. de pacientes mexicanos con SII (síndrome) y sin SII (controles) y de otras partes del mundo. Se identifican siete clústeres en colores: en azul se observa la mayoría de las secuencias mexicanas y en rosa dos secuencias de pacientes mexicanos con SII.

¿ Discusión

Nuestro trabajo demuestra que Blastocystis sp. fue identificado en 25% de los pacientes con SII estudiados y fue el parásito más frecuentemente encontrado en nuestra serie.

En el presente trabajo se incorporaron pacientes con SII en proporción de 5:1 a favor de las mujeres, con un predominio en el subtipo con estreñimiento. Un estudio multicéntrico reciente realizado en México encontró una proporción de mujeres y hombres con SII de 3:1, con predominio del subtipo mixto seguido del estreñimiento.5 La mayoría de los estudios sobre la epidemiología del SII muestran que existe un predominio del género femenino.2 Es probable que la alta frecuencia de mujeres en nuestro estudio se haya visto incrementada no sólo por factores intrínsecos de este síndrome, sino también a factores socioculturales, como lo han descrito otros trabajos, en los que muestran que los hombres pueden ser menos participativos, particularmente en estudios donde se lleven a cabo procedimientos colonoscópicos.26

En nuestro estudio también se encontró que la mayoría de las colonoscopias fueron normales, lo cual está acorde a lo encontrado por Chen y colaboradores,27 quienes estudiaron a 99 individuos sanos portadores de Blastocystis, cuya media de edad fue 57.2 ± 10.3 años y en los que encontraron que 17% tuvieron pólipos y 2% divertículos.

Aunque algunos artículos señalan a Blastocystis como responsable del SII,12,28,29 su papel patógeno aún continúa en debate.13,27,30 Un estudio de casos y controles desarrollado en pacientes paquistaníes con SII demostró una asociación significativa entre la presencia de Blastocystis sp. y el desarrollo de este síndrome (p = 0.001). Los investigadores, utilizando exámenes CPS, detectaron Blastocystis en las heces de 32% de los pacientes con SII y sólo 7% de los controles.28 Un estudio reciente de nuestro grupo, realizado en pacientes con SII, identificó mediante CPS al Blastocystis sp. como el parásito más frecuente, seguido por Endolimax nana y Entamoeba histolytica/E. dispar (16%, 9% y 3%, respectivamente); además, Blastocystis mostró una tendencia de asociación con diarrea (p = 0.053; razón de momios 2.73).31 En el presente trabajo, en el que utilizamos análisis de PCR, encontramos una mayor frecuencia de Blastocystis sp. que en nuestro estudio previo debido probablemente a la alta sensibilidad de la técnica. Todos los portadores de Blastocystis sp. recibieron tratamiento farmacológico con base en la premisa de que si existe un agente potencialmente patógeno contra el que hay fármacos eficientes y seguros debe ser tratado, y a que el tratamiento ha sido recomendado en aquellos portadores de este microorganismo que presenten síntomas;13 aunque el objetivo del presente trabajo no incluyó dar seguimiento a los enfermos, pues esto es parte de la rutina hospitalaria.

El análisis microbiológico mostró que todas las bacterias pertenecían a la flora intestinal, a excepción la un caso con Salmonella paratyphi A el cual recibió tratamiento farmacológico ad hoc. No se identificaron adenovirus o rotavirus.

Rodríguez y colaboradores20 encontraron una prevalencia de Blastocystis mayor de 60% en niños de zonas rurales, y discutieron que al encontrarse las parasitosis en constante transición debido a la introducción de mejoras en los servicios sanitarios, la movilización de individuos, los cam bios en los hábitos higiénico-dietético y las relaciones zoonóticas, que ha favorecido la presencia de otros organismos como nuevos patógenos para el hombre desplazando a otros, como puede ser el caso de Blastocystis.

Un hallazgo relevante del presente trabajo fue que la mayoría de las secuencias de Blastocystis sp. de portadores mexicanos se agruparon en un solo clúster del árbol filogenético con algunas secuencias de parásitos de Japón, Dinamarca y de un origen no documentado, fortaleciendo la hipótesis de que existen varios genotipos o un complejo de linajes clonales de Blastocystis sp. que explicaría las diferencias en la prevalencia y patogenicidad observadas en diferentes áreas geográficas.30,32 Además, la presencia de dos secuencias de parásitos exclusivamente en pacientes con SII, también sugiere la presencia de genotipos autóctonos potencialmente patógenos, los cuales por distintos procesos evolutivos cambiaron y se fijaron localmente.32

Si bien en el presente artículo, se incluyó una serie de casos con SII que fueron estudiados con técnicas convencionales para identificar organismos patógenos cuyo desempeño cumple con las normas de calidad que exige la Secretaría de Salud de México, presenta algunas deficiencias como el no contar con un grupo control y no aplicar la técnica de PCR para la detección de otros parásitos. Por ello, consideramos importante que se lleven a cabo estudios de casos y controles, e idealmente de causalidad, en los que se incluyan aspectos clínicos soportados por técnicas moleculares para esclarecer el papel patógeno de Blastocystis en nuestro país. Rodríguez y colaboradores20 proponen que si continúa incrementándose la frecuencia de este microorganismo y no se establecen mecanismos dirigidos hacia su control, se corre el riesgo de que la blastocistosis deje de ser un problema individual de salud para convertirse en un problema de salud pública.

¿ Conclusión

Blastocystis sp. fue identificado en 25% de los pacientes con SII estudiados. Nuestros datos apoyan la hipótesis de linajes clonales en este parásito en distintas regiones del mundo; es decir, que hay muchos parásitos genéticamente idénticos en distintas partes del mundo, aunque por procesos evolutivos se podrían encontrar eventualmente poblaciones autóctonas.

¿ Agradecimiento

Estudio realizado con el apoyo del proyecto CONACYT N° 69589.


Correspondencia: Dr. Pablo Maravilla.
Dirección de Investigación, México D. F. C.P. 14080, México.
Teléfono: 5528 4228.
Correo electrónico: maravillap@yahoo.com.

Recibido el 20 de junio de 2011;
aceptado el 1 de septiembre de 2011.

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