Los datos de los perfiles transcriptómico (n = 39) y metilación (n = 70), así como las características clínico-patológicas de pacientes peruanos diagnosticados con CHC y programados para resección hepática entre los años 2006 y 2016 en el INEN fueron obtenidos a partir de un estudio previo y descargados desde la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO)15. Brevemente, ninguna de las muestras colectadas proviene de pacientes que hayan recibido quimioterapia antes de la resección hepática, en acuerdo a las recomendaciones de la Asociación Europea para el Estudio del Hígado (EASL)17. Las muestras fueron colectadas en pares, un tejido de CHC y un tejido de hígado adyacente no-tumoral (HNT) extraído del margen quirúrgico (≥ 2 cm). Aproximadamente 50 mg de cada tipo de tejido (CHC y HNT) fueron flash congelados y almacenados a -150°C en el Banco de Tejidos Tumorales del INEN antes del análisis. Las variables consideradas en el presente estudio incluyen datos demográficos, de laboratorio, histológicos y de la infección por VHB. Los detalles de cada variable se muestran en la tabla S1.

Los pacientes fueron clasificados de acuerdo con el nomograma de pronóstico de supervivencia para tumores > 10 cm18. Las variables preoperativas consideradas en este nomograma son: i) presencia de cirrosis; ii) múltiples lesiones tumorales; iii) invasión vascular macroscópica y iv) ruptura espontánea de tumor. El puntaje final permite clasificar las muestras en tres grupos de sobrevida tal que: G1 con una alta probabilidad de supervivencia a largo plazo (0 puntos), G2 con 60% de probabilidad de recurrencia dentro de los 12 meses (entre uno y 100 puntos) y G3 con la más alta mortalidad postoperatoria (> 100 puntos).

La detección del ADN de VHB en los tejidos fue realizada como se describió previamente19. Brevemente, el ADN genómico se extrajo mediante el método de fenol-cloroformo y la cuantificación se realizó utilizando el kit dsDNA en la plataforma Qubit® (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). Todas las muestras se examinaron para detectar la presencia de ADN del VHB utilizando el sistema de PCR QX200™ Droplet Digital™ (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). La secuenciación de VHB se realizó utilizando el kit de secuenciación BigDye™ Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.). La filogenia del VHB se determinó utilizando el modelo de dos parámetros de Kimura y el método de neighbor joining en la versión 7 del software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA, University Park, PENN, EE. UU.). Los datos de las secuencias se pueden descargar desde el European Bioinformatics Institute (EBI) con código de acceso PRJEB21100 (https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB21100).

El perfil transcriptómico se analizó a partir de un grupo de muestras de CHC peruanos obtenidos de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO, Bethesda, MD, EE. UU.), bajo los códigos GSE136247 y GSE11158015. El transcriptoma de estas muestras se obtuvo utilizando los microarreglos GeneChip™ Human Transcriptome Array 2.0 y el GeneChip™ WT PLUS Reagent Kit (Applied Biosystems, Waltham, MA, EE. UU.). Los datos transcriptómicos fueron normalizados mediante Robust Multichip Average (RMA), mientras que el efecto de lote fue corregido utilizando el algoritmo ComBat de la librería limma (lenguaje R)20. La matriz (genes x muestras) fue posteriormente colapsada mediante el algoritmo collapse_genes-09 (Fred's Softwares, Toulouse, Francia). Los genes diferencialmente expresados (GDE) se obtuvieron utilizando la librería de R, limma, con un valor p corregido (valor q) de 0.05, y siguiendo el flujo de trabajo recomendado20. Adicionalmente, los 5,000 genes más variables en el tejido CHC fueron identificados utilizando la desviación estándar. Los mapas de calor basados en la agrupación jerárquica no supervisada se generaron mediante la librería de R, pheatmap. La identificación de vías metabólicas de interés se realizó utilizando el algoritmo Sample Enrichment Score (SES) y las bases de datos KEGG, Reactome (reactome_2018803), Gene Ontology-Cellular Component (C5_CC) y MSigDB Hallmarks (H) compiladas por Fred's Softwares21. Los códigos fuente y las bases de datos de Fred's Software están disponibles en: https://sites.google.com/site/fredsoftwares/products.

El perfil de metilación de las muestras de CHC peruanos con código GSE136319 y GSE136380 fueron obtenidos a partir de la base de datos GEO. El metiloma de estas muestras se obtuvo utilizando los microarreglos e Infinium HumanMethylation450K MethylationEPIC BeadChip (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Las posiciones diferencialmente metiladas (PDM) fueron identificadas mediante la librería R minfi utilizando un valor q a 0.0515. Los criterios considerados para el análisis de metilación fueron: Δβ promedio entre CHC y HNT > 5% (para las posiciones hipermetiladas) o≤5% (para las posiciones hipometiladas). Mediante el cálculo de la desviación estándar se identificaron igualmente las 5,000 posiciones con metilación más variable. La clasificación según asociación a «islas CpG» y «estructura genética» se realizó según lo definido por Illumina. Los mapas de calor basados en la agrupación jerárquica no supervisada se generaron mediante la librería de R, pheatmap. Para la identificación de vías metabólicas de interés se utilizó el algoritmo SES, y se utilizaron los genes que se encontraban asociados a las CpG de interés, según lo definido por Illumina.

Los análisis de factor múltiple (AFM) y de componentes principales (ACP) se realizaron en R utilizando la librería FactoMineR22. Las variables con datos incompletos fueron tratados con la función imputeMFA de la librería R missMDA. Brevemente, como se recomienda en la guía de FactoMineR, se aplicó un AFM, puesto que nuestros datos contaban con variables numéricas y categóricas. El AFM fue realizado según las recomendaciones establecidas de la librería, y todos los grupos fueron considerados como variables relevantes, y ningún dato suplementario fue incorporado en el análisis. Adicionalmente, los t-test y χ2 fueron realizados en R. La significancia estadística fue evaluada uni o bilateralmente de acuerdo a las circunstancias. Todas las figuras del presente artículo fueron generadas en R y GraphPad Prism v8 (GraphPad Software, Boston, MA, EE. UU.).

Todas las muestras incluidas en el presente estudio provienen de pacientes voluntarios, que aceptaron el uso de sus muestras y datos (en anonimidad) para investigación. El proyecto con código INEN 10-05, fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Ética en Investigación del INEN.

En el presente estudio se incluyeron 74 pacientes peruanos con CHC tratados en el INEN por resección hepática. La edad promedio de estos fue de 45.9 años. De acuerdo a la mediana de la edad (44 años), los pacientes se clasificaron en adolescentes y jóvenes adultos (≤ 44, AJA), y en individuos de mediana o avanzada edad (> 44, MAE). El grupo AJA representa más de 50% (n = 39) de la población del estudio con CHC, con una media de 27 años, mientras que el grupo MAE (47.3%; n = 35) presenta una media de 67 años. La proporción según sexo (M/F) fue de dos hombres por cada mujer (2/1) para toda la cohorte de pacientes; sin embargo, en el grupo MAE, la proporción fue el doble (4/1). La media del diámetro tumoral fue de 14.4 cm (AJA, 14.2 cm y MAE, 14.6 cm; p > 0.05), y la gran mayoría de pacientes (∼80%) presentaron un tumor con un tamaño > 10 cm de diámetro. El nomograma de pronóstico de supervivencia para tumores > 10 cm18 pudo ser retrospectivamente aplicado en 36 pacientes (AJA = 21 y MAE = 15), 83% de los pacientes incluidos se encuentran en los grupos G1 (n = 17) y G2 (n = 13), ambos grupos presentan una mayor probabilidad de supervivencia en comparación con el G3 (n = 6), donde todos los pacientes fallecieron antes de cumplir los tres años posteriores a la operación (fig. 1a). El antígeno de superficie de hepatitis B (AgHBs) se detectó en 53% de pacientes (AJA = 72%, y MAE = 31%), mientras que el ADN del VHB se detectó en 86% de la población con CHC estudiada y el único subgenotipo identificado fue el F1b. Finalmente, el grupo AJA y MAE presentaron 92 y 80% (p > 0.05) de casos con presencia de ADN viral, respectivamente (tabla 1).

Figura 1.

Evaluación de las variables clínicas y demográficas en pacientes peruanos con CHC. a) Curva de sobrevida de G1 (n = 17), G2 (n = 13) y G3 (n = 6), de 36 pacientes, clasificados según nomograma. Como resultado del análisis de AFM se muestra en un gráfico de componentes principales: b) la contribución de cada grupo de variables, y c) de las variables más relevantes dentro de cada grupo, para las dos dimensiones más relevantes (Dim. 1 y 2). Lab. (azul); Demog (verde y rojo); VHB (azul claro); Histo (amarillo y gris); Tumor (marrón y fucsia). Datos cualitativos (ql) y cuantitativos (qt). ACP de datos de d) expresión génica y e) metilación del ADN de pacientes peruanos representados según la infección por VHB, edad (AJA y MAE), y tipo de tejido (CHC y HNT).

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Para el análisis de AFM, las variables fueron organizadas en ocho grupos, datos de laboratorio clínico (Lab.), demográficos cualitativos y cuantitativos (Demog ql y qt), asociados a la infección del VHB, histológicos cualitativos y cuantitativos (Histo ql y qt), y asociados al tumor cualitativos y cuantitativos (Tumor ql y qt) (Sup. Tabla 1). El análisis de AFM utilizando todos los datos clínicos y demográficos de los pacientes con CHC demostró que los grupos de variables Demog ql, Histo ql, Histo qt, Lab y Tumor qt, fueron los parámetros con mayor contribución (fig. 1b). Las variables con mayor relevancia dentro de estos grupos fueron, según el AFM, la edad, sobrevida, número de células mitóticas (mitosis), AFP, diámetro tumoral, bilirrubina total y albúmina (fig. 1c).

Adicionalmente, debido a la alta tasa de infección por el VHB, se realizó un ACP para determinar el efecto del VHB en la expresión y metilación. En ambos escenarios se observa una mayor proporción de pacientes AJA infectados con VHB, demostrando que el VHB actúa como un factor de confusión asociado a la edad (fig. 1d,e).

El perfil transcriptómico del CHC y HNT de un total de 39 pacientes (AJA = 19 y MAE = 20) se obtuvo a partir de datos previamente publicados15. La evaluación de los 5,000 genes más variables en el CHC demostró que no existe diferencia significativa entre los dos grupos etarios (p > 0.05) (fig. 2a). Sin embargo, un análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado de los 5,000 genes más variables en el tejido CHC permitió evidenciar que estos se dividían en tres grandes grupos (C1-C3). Los genes que se encontraban en C1 estaban principalmente asociados con la regulación de la expresión mediante la modificación de histonas, mientras que en C2 la mayoría participaban en la cascada del complemento y la coagulación, y en C3 se encontraban genes que participan en la respuesta inmune. Otras vías menos representativas fueron la regulación de hormonas (C1), metabolismo del retinol y lípidos (C1), así como la reparación del ADN (C2) (fig. 2b).

Figura 2.

Análisis del perfil transcriptómico y de metilación del ADN de pacientes peruanos con CHC. Se identificaron los 5,000 genes (a,b) y 5,000 CpG más variables (c,d). Utilizando (a) los niveles de expresión (AJA = 19, MAE = 20) y (c) de metilación del ADN (AJA = 39, MAE = 35) de estos se generaron mapas de calor basados en una agrupación jerárquica no-supervisada. En (a) se destacan tres grandes grupos de genes C1, C2 y C3. Las vías con mayor valor de significancia y de fold enrichment (b) de los 5,000 genes, y d) de las 5,000 CpG más variables se representaron en un gráfico de dispersión. El fold enrichment es la proporción de genes de la lista de interés que se encuentra en la vía evaluada.

(1.29MB).

El perfil de metilación del CHC y HNT de 70 pacientes (AJA = 36 y MAE = 34) se obtuvieron de un estudio previo15. Similar al análisis transcriptómico, las 5,000 CpG más variables fueron identificadas, y se realizó un agrupamiento jerárquico no supervisado. En contraste a su contraparte no-tumoral (HNT), el CHC peruano muestra un aumento global de metilación del ADN (hipermetilación), con mayor intensidad en los pacientes jóvenes (fig. 2c). Además, estas CpG están principalmente asociadas a genes implicados en la diferenciación celular, con marcas de metilación del residuo de lisina en la posición N-terminal 27 de la proteína histona H3 [H3K27 (me3)], y blancos del complejo represivo polycomb 2 (PRC2) (fig. 2d).

Para una mejor comprensión de la metilación del ADN de las CpG se realizó un mapa de calor sobre los genes regulados positiva y negativamente15. Se consideraron de forma independiente las regiones que abarcan la estructura genética y la isla CpG. Las CpG asociadas a genes regulados negativamente (en su mayoría hipermetilados) se detectaron principalmente en islas CpG dentro de las regiones promotoras de TSS200 y TSS1500; mientras que las CpG asociadas a genes regulados positivamente (en su mayoría hipometilados) se ubicaron en regiones no relacionadas a islas CpG en el cuerpo del gen (fig. 3a,b). La integración genómica en CHC también reveló un predominio de vías relacionadas al metabolismo celular, sin embargo, también resaltan vías relacionadas a procesos de diferenciación celular y del sistema inmune.

Figura 3.

Análisis integrado del perfil transcriptómico y de metilación del ADN de pacientes peruanos con CHC. Se utilizaron mapas de calor basado en una agrupación jerárquica no-supervisada para mostrar los niveles de metilación del ADN (valor β) de (a) los genes diferencialmente expresados (GDE) regulados negativamente y (b) positivamente, en AJA (n = 39, panel superior) y MAE (n = 35, panel inferior). a,b) El dendrograma izquierdo muestra la anotación de la isla CpG y estructura del gen. c) Las vías con mayor valor de significancia de fold enrichment asociados al análisis integrado de la expresión de génica y metilación del ADN, se ilustraron utilizando un gráfico de dispersión. El fold enrichment es la proporción de genes de la lista de interés que se encuentra en la vía evaluada.

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Finalmente, se exploraron las diferencias entre los grupos definidos según el nomograma de pronóstico de supervivencia para tumores con un tamaño > 10 cm, a nivel transcriptómico y de metilación del ADN. Únicamente 36 pacientes (perfil transcriptómico = 17 y perfil de metilación del ADN = 36) contaban con las variables preoperativas necesarias para poder ser evaluados. Un total de 17 pacientes obtuvieron 0 puntos, por lo tanto fueron clasificados en G1, mientras que 13 obtuvieron entre 1-100 puntos y seis muestras > 100, siendo clasificadas en los grupos G2 y G3, respectivamente (tabla 1). Según esta clasificación, 47% de pacientes tienen una alta probabilidad de sobrevida a largo plazo, mayormente ≤ 44 años (AJA = 12; MAE = 5), 36% una alta probabilidad de recurrencia durante los primeros 12 meses (AJA = 7, MAE = 6), y 17% alta probabilidad de muerte postoperatoria (AJA = 2, MAE = 4). A pesar de estas diferencias clínicas, los análisis no demostraron diferencias significativas a nivel transcriptómico, ni de metilación del ADN entre los tres grupos. Por esta razón no se profundizó más con estos análisis. Sin embargo, se observó que más de 50% de pacientes ≤ 44 años (57%) tienen una alta probabilidad de sobrevida a largo plazo.