Reclutamos a pacientes con EC del puerto de Veracruz, México, para el presente ensayo abierto. Los criterios de inclusión fueron los siguientes: >18 años de edad, autorreporte de frecuencia de heces de 3 movimientos intestinales por semana o menos, autorreporte de consistencia de heces de tipo 1-4 en la Escala de Heces de Bristol, y cumplir con los criterios de diagnóstico de Roma IV para estreñimiento funcional12,13.

A los pacientes que estaban recibiendo tratamiento farmacológico se les solicitó que interrumpieran el tratamiento por al menos una semana, para poder ser evaluados. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: trastornos gastrointestinales y otros que pudieran afectar la motilidad intestinal, cirugía abdominal previa, terapia activa con medicamentos conocidos por afectar la motilidad intestinal, causas secundarias de estreñimiento, defecación disinérgica, inercia colónica, problemas anorrectales, intolerancia a la lactosa, alergia a leche de vaca y soya, consumo regular de probióticos, prebióticos, suplementos de fibra y laxantes, uso de antibióticos hasta 4 semanas antes del inicio del ensayo, abuso activo de alcohol, drogas o medicamentos. La prevalencia del estreñimiento es casi dos veces más común en mujeres, por lo que decidimos incluir solo a mujeres, para evitar factores potencialmente confusos.

Se les indicó a los pacientes ingerir una cápsula diaria de Alflorex®, con 1×109 de UFC/g de B. infantis cepa 35624, por un periodo consecutivo de 8 semanas, manteniendo sus hábitos alimenticios regulares. La B. infantis 35624 también es conocida como B. longum subespecie infantis (https://www.precisionbiotics.com/es/), pero además, ha sido catalogada (de manera más precisa) como B. longum subespecie longum (el error en asignación original fue resultado del uso único de la clasificación taxonómica basada en 16S ARNr parcial)14. El probiótico fue donado por la compañía Menarini México (Ciudad de México, México), la cual solo proporcionó el fármaco y no intervino en el diseño del estudio o en el análisis de los resultados.

Se les informó a los pacientes que estaban siendo invitados a participar en un estudio cuyo objetivo era investigar el efecto de un probiótico sobre sus síntomas y la composición de la microbiota intestinal, sin prometer de manera explícita un efecto benéfico. Considerando la cantidad de producto en cada cápsula (247mg) y la concentración del probiótico (1×109UFC/g), cada cápsula proporcionó 2.47×108UFC. Los pacientes respondieron un cuestionario respecto a parámetros clínicos como consistencia de heces, percepción de intensidad de sensación de distensión y días sin síntomas, en línea de base y al final de la administración de los probióticos. La consistencia de heces fue evaluada por los pacientes utilizando la Escala de Heces de Bristol15, en la cual el 1 representa trozos duros y el 7 representa heces aguadas. La percepción de la intensidad de sensación de distensión fue expresada utilizando una escala visual análoga de 0 a 100. Se evaluó la mejoría global, utilizando la pregunta general de síntomas: «En los últimos 7 días, ¿consideras que tuviste un alivio adecuado de tus síntomas de estreñimiento?» Se les dio instrucciones a los pacientes de usar 17g diarios de polietilenglicol, de forma regular de ser necesario, si se requería terapia de rescate.

Las muestras fecales fueron recolectadas por los pacientes en sus casas, en línea de base y al final de la administración de probióticos. Las muestras fueron colocadas en hieleras con paquetes de gel congelados y llevadas a nuestro laboratorio en el lapso de una hora, donde fueron colocadas a −20°C, hasta ser procesadas. Debido a que la homogenización de las heces evita una evaluación precisa de las comunidades microbianas16, descongelamos las muestras y obtuvimos las alícuotas para el análisis, principalmente de la parte media del material fecal disponible de cada muestra17. El ADN genómico total fue obtenido y purificado de una alícuota (100mg) de cada muestra fecal, utilizando centrifugación para la disrupción celular, en conjunto con un kit comercial de extracción de ADN (Wizard® Genomic DNA Purification Kit Protocol, Promega Corporation, Madison, Wisconsin, EE.UU.). Se procesaron dos alícuotas separadas de la muestra de línea de base del último paciente (ID de muestra: S19) para evaluar la replicabilidad del procedimiento. Las muestras de ADN (n=27, 26 de 13 pacientes más un duplicado de S19) fueron ajustadas a 150ng/μl y enviadas a Molecular Research LP (Shallowater, Tejas, EE.UU.). Se realizó una PCR para amplificar una región semiconservada del gen 16s ARNr utilizando los cebadores 515F (GTGYCAGCMGCCGCGGTAA) y 806R (GGACTACNVGGGTWTCTAAT). La secuenciación de alto rendimiento de ADN de los amplicones de PCR fue realizada en un instrumento MiSeq (Illumina, San Diego, California, EE.UU.), de la manera descrita en otra instancia18. A menos que se declare de otra manera, solo los resultados de los 13 pares de muestras (n=26), usando la primera réplica S19, se muestran y discuten.

Utilizamos diferentes herramientas en QIIME219 v.2020.2 para analizar los datos de secuenciación, usando los parámetros por defecto, a menos que se especifique de otra manera. El laboratorio de secuenciación proporcionó asignación taxonómica libre, utilizando una base de datos curada, pero los resultados solo se mencionan en el contexto de nuestra asignación taxonómica en QIIME2, usando la base de datos Greengenes 13.8. El método filogenético UniFrac20 fue utilizado para comparar comunidades microbianas, con distancias ponderadas y sin ponderar21.

Es práctica común analizar los diferentes taxones bacterianos por separado. Sin embargo, este abordaje no es necesariamente el mejor para comprender las fluctuaciones microbianas en ecosistemas complejos, donde coexisten diferentes tipos y cantidades de microbios. Por lo tanto, usamos el SAS® University Edition (SAS Institute, Cary, Carolina del Norte, EE.UU.) para realizar el análisis multivariado para diferentes taxones al mismo tiempo. En los casos necesarios se usó la prueba de Wilcoxon de rango con signo para comparar variables (p.ej., abundancia relativa de bacterias) entre ambos periodos de tiempo (de línea de base y final). También realizamos análisis de correlación utilizando los valores de línea base y final para los taxones individuales, al igual que entre las diferentes combinaciones de los puntos de tiempo y taxones (p.ej., valores de línea base para taxón A vs. valores finales para taxón B), para investigar cualquier relación que pudiera impactar la variabilidad de microbios a lo largo del tiempo. Las gráficas fueron generadas utilizando SAS y PAST v.3.25.

Se requirió de un consentimiento informado por escrito para la participación en el presente estudio. Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con el código de ética de la OMS (Declaración de Helsinki) y aprobados por el comité de ética local del Instituto para la Investigación Biológica Médica (Universidad Veracruzana, 2018-013R). Los autores declaran que el presente artículo no contiene información que permita identificar a los pacientes.

Se incluyó a 19 pacientes mujeres, pero solamente 13 pudieron completar el protocolo (tabla 1). Previo al estudio, 3 pacientes no estaban tomando medicamento o suplemento para tratar su estreñimiento, 6 tomaban suplementos de fibra y 11 usaban laxantes (6 polietilenglicol, 3 lactulosa).

De las 13 pacientes reclutadas, 6 (46%) reportaron una mejoría en la Escala de Heces de Bristol de más del 50%, en comparación con la línea de base, y 10 (77%) de las 13 participantes reportaron una mejoría de síntomas en general. La intensidad de la sensación de distensión fue significativamente más baja después de la administración de probióticos (67% vs. 42%, p=0.02) (tabla 2) y el porcentaje de tiempo (en días) sin síntomas también fue más bajo posteriormente al probiótico (49% vs. 39%), pero la diferencia no fue significativa (p=0.48). Solo 2 pacientes reportaron haber tomado el medicamento de rescate, de manera intermitente. Sin embargo, es probable que estos resultados tengan relevancia clínica limitada debido a un posible efecto placebo y a la falta de un grupo control.

Después de la demultiplexación, obtuvimos 2,069,625 secuencias 16S de 27 muestras fecales (media: 76,652 secuencias/muestra, mín.: 25,964, máx.: 170,946). La utilización de DADA222 para el filtrado de calidad resultó en 1,868,215 secuencias (∼90% del original), utilizando 280 nucleótidos como longitud de truncado.

Usando una profundidad de rarefacción de 24,000 secuencias/muestra, DADA2 reveló la presencia de 1,123 variantes de secuencia de amplicones (VSA) que pertenecieron a 120 géneros de 16 filos. No existieron diferencias significativas en el número de VSA, valores de diversidad Shannon, valores de uniformidad de Pielou y los valores de diversidad filogenética de Faith (fig. 1). Con la excepción de los valores de diversidad filogenética de Faith, existió una disimilitud notable en la dispersión de las muestras, entre la línea de base y los periodos finales (fig. 1).

Figura 1.

Diagramas de aja con jitter que muestran métricas de diversidad alfa. No hubo diferencia estadísticamente significativa entre inicio y final, pero los valores de la mayoría de las métricas mostraron una mayor variación después del probiótico. Los diagramas se construyeron en PAST v.3.25. ASVs: variantes de secuencia de amplicón.

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Un total de 99.3% de las lecturas del gen 16S podrían ser clasificadas en un filo dado, pero solo el 63% fueron asignadas a un género. Este porcentaje es común23, pero la mayoría de los artículos de investigación prefiere no declarar los porcentajes de lecturas asignados a los diferentes niveles taxonómicos. Siete filos sumaron el ∼99% de todas las lecturas (Firmicutes: 55.8%, Bacteroidetes: 15.0%, Cianobacteria: 10.2%, Tenericutes: 5.4%, Proteobacteria: 5.3%, Actinobacteria: 4.9% y Verrucomicrobia: 2.0%). Estos resultados concuerdan parcialmente con los resultados proporcionados por el laboratorio de secuenciación que utiliza una base de datos diferente para las asignaciones taxonómicas (Firmicutes: 60.6%, Bacteroidetes: 15.5%, Cianobacteria: 10.3%, Proteobacteria: 6.5%, Actinobacteria: 4.9% y Verrucomicrobia: 2.0%), con la excepción de Tenericutes, que solo sumó el 0.003% de todas las lecturas. Con pocas excepciones, la variación en abundancia relativa de taxones entre dos réplicas de la línea de base de la muestra S19 fue menor en comparación con la variación entre la línea de base y los valores finales de todos los pares de muestras.

La abundancia relativa de cada filo reveló una variación interindividual alta, al igual que una amplia diferencia en la variación a lo largo del tiempo para cada sujeto (fig. 2), como se muestra en otra instancia. Por ejemplo, 7 de las 13 pacientes (54%) experimentaron una disminución en la abundancia relativa de Firmicutes de 37% en promedio, mientras que 6 de las 13 pacientes (46%) mostraron un incremento en el taxón de 16%, en promedio (tabla 2). En otras palabras, el cambio en Firmicutes a lo largo del tiempo sucedió en una proporción similar de pacientes (54% vs. 46%), pero el cambio fue más pronunciado (disminución de 37% vs. aumento de 16%) en los pacientes que experimentaron una disminución en dicho taxón. Independientemente de esto, la diferencia en Firmicutes entre los dos periodos de tiempo no llegó a la significación estadística (p=0.28). En el caso de Bacteroidetes, 5 de las 14 pacientes (38%) mostraron una disminución de 12% en el taxón, en promedio, mientras que 8 de las 13 pacientes (62%) mostraron un incremento de 18%, en promedio (tabla 2). La diferencia en Bacteroidetes entre los dos puntos temporales no llegó tampoco a la significación estadística (p=0.38) (tabla 2). Dos pacientes mostraron una pequeña disminución en Proteobacteria (de 7.4% a 2.6%, y de 1.97% a 1.94%, respectivamente) posteriormente a la administración del probiótico, mientras que otras 11 pacientes mostraron un aumento promedio de 8.5% en el taxón (fig. 2). La diferencia en Proteobacteria entre los periodos de línea de base (3.2%) y final (10.1%) fue estadísticamente significativa (p=0.01), aunque fue principalmente causada por dos participantes (fig. 2) y no estuvo claramente asociada con ningún taxón en particular (tabla 2).

Figura 2.

Porcentajes de lecturas del gen 16S rRNA a nivel de filo para los 13 pacientes al inicio y al final de la administración del probiótico. El propósito de esta figura es ayudar a visualizar la alta variación interindividual (separación de puntos dentro de cada punto de tiempo), así como la gran diferencia en la variación a lo largo del tiempo (cambio en las lecturas de 16S del inicio al final) para cada sujeto.

Las gráficas fueron construidas en SAS.

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La abundancia relativa del género Bifidobacterium fue relativamente alta (el décimo género más abundante) en nuestro análisis en QIIME2 (promedio 3.4%, mín.: 0.07%, máx.: 31.5%) y en los resultados del laboratorio de secuenciación (promedio 3.3%, mín.: 0.05%, máx.: 30.8%).

Observamos 9 VSA que estuvieron relacionadas con Bifidobacterium, pero la mayoría fueron bajas en abundancia y mostraron baja prevalencia (tabla 3).

Utilizamos la abundancia relativa de las lecturas del 16S de 6 de los filos más abundantes, en diferentes combinaciones, para encontrar el valor más bajo de la lambda de Wilks. En consecuencia, la combinación de 3 filos (Firmicutes, Proteobacteria y Verrucomicrobia) fue asociada con el valor más bajo (tabla suplementaria S1). Esto es interesante porque implica que la combinación de esos 3 taxones puede ser más precisa para analizar las diferencias entre los dos puntos temporales.

La abundancia relativa de Actinobacteria (R2=0.5, p=0.007) presentó la correlación más fuerte entre los periodos de línea de base y final, pero esto fue causado por los datos de un paciente (tabla suplementaria S2). El único otro filo que mostró una tendencia a la significación fue la Proteobacteria (R2=0.3, p=0.046, tabla suplementaria S2). También examinamos las correlaciones entre los diferentes filos en los diferentes puntos temporales (tabla suplementaria S3). De manera interesante, existió una correlación inversa entre los valores de línea de base de Firmicutes y Proteobacteria (R2=0.73, p=0.0002), como se mostró recientemente en un estudio sobre la microbiota en leche24. Otro hallazgo interesante fue la correlación positiva entre la línea de base de Cianobacteria y Proteobacteria (R2=0.82, p=2.4×10-5). Las cianobacterias son frecuentemente consideradas contaminantes, pero Ley et al.25 propusieron la interesante posibilidad de que las cianobacterias intestinales sean descendientes de cianobacterias no fotosintéticas ancestrales que se adaptaron a la vida dentro del tubo digestivo.

La utilización de PCoA y agrupamiento UPGMA en distancias UniFrac no ponderadas sugirió poca variación en las dos réplicas del S19 y la presencia de dos grupos de muestras claros que se explicaron parcialmente por la administración del probiótico (fig. 3A y C). Debido a la posible existencia de enterotipos (grupos de muestras identificables por la variación en la presencia de taxones específicos y sus niveles26), retiramos los diferentes taxones, uno por uno, para investigar si la ausencia de un taxón dado explicaría dicho agrupamiento. Sin embargo, no encontramos evidencia que sugiera que el agrupamiento fue debido a la presencia (o ausencia) de un taxón en particular. De manera interesante, los dos grupos de muestras desaparecieron al analizar los datos de grupos separados de taxones seleccionados (p.ej., Firmicutes, Proteobacteria y Verrucomicrobia), pero la significación de este hallazgo aún no es clara para nosotros. A diferencia de los resultados sobre las distancias UniFrac no ponderadas, el análisis de las distancias UniFrac ponderadas mostró una separación de réplicas de S19 más fuerte, pero no reveló un agrupamiento significativo de muestras (fig. 3B y D). Independientemente de cualquier agrupamiento visual, la prueba PERMANOVA no mostró diferencias significativas en las distancias UniFrac no ponderadas (p=0.12) o ponderadas (p=0.81).

Figura 3.

Gráficos PCoA y árboles UPGMA utilizando distancias UniFrac no ponderadas y ponderadas. Gráficos PCoA usando distancias no ponderadas (A) y ponderadas (B), árboles UPGMA usando distancias no ponderadas (C) y ponderadas (D). En A y B, las muestras de línea de base están representadas por cuadrados azules llenos y las muestras finales por una X roja. La muestra que se procesó por duplicado (S19, línea de base) se muestra con un símbolo diferente (cuadrados azules vacíos) para una mejor visualización. Los árboles se construyeron utilizando 10,000 muestras de arranque. El índice de similitud Euclidiana se utilizó para todas las gráficas en PAST v. 3.25.

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El índice de masa corporal y la edad fueron las únicas variables continuas asociadas con los pacientes y no explicaron significativamente el número de VSA observado. Algunos de los taxones estuvieron relacionados con el número de VSA, en particular el productor de butirato, Oscillospira (R2=0.55, p<0.0001), un miembro enigmático de Firmicutes (familia Ruminococcaceae) de la microbiota intestinal humana que ha sido demostrado que tiene una asociación positiva con delgadez y salud27 (tabla suplementaria S4).

El concepto de microbioma central se refiere a las especies (p.ej., VSA) que están presentes en la mayoría de las muestras en un medio ambiente dado, por ejemplo, las heces humanas. Pocas unidades taxonómicas operacionales (UTO) fueron compartidas por el 50% de las muestras (122 de 1,123, o 10.9% de todas las VSA), de línea de base (153, 19.1%) o del final (105, 12.3%), lo que implica que la mayoría de las VSA fueron singulares para cada individuo.