Este estudio transversal incluyó a 21 pacientes egipcios con CUCI activa que fueron reclutados de la clínica ambulatoria de gastroenterología del Hospital Universitario Principal de Alejandría y del ala de gastroenterología para pacientes internados en dicho hospital y a 20 sujetos saludables egipcios para el grupo control emparejados por edad, sexo e índice de masa corporal. Los hábitos alimentarios de todos los participantes fueron evaluados por medio de un cuestionario de frecuencia de alimentos.

Malignidad; intervención quirúrgica reciente en intestino delgado o grueso (últimos 6 meses); diarrea infecciosa, incluida diarrea bacteriana, viral y por parásitos, diagnosticada con análisis de heces, cultivo y proteína C reactiva (PCR) para ciertos patógenos; antecedentes de uso prolongado de antibióticos; abuso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos; antecedentes de corticoesteroides, metotrexato, azatioprina o 6-mercaptopurina en los últimos 3 meses; terapia biológica; otras enfermedades autoinmunes; embarazo; quemadura grave; sepsis; enfermedades renales y hepáticas graves; diabetes mellitus; vegetarianismo puro; adicción al alcohol u otras sustancias; incapacidad para otorgar el consentimiento informado debido a trastorno mental. También se excluyó a los niños. Se requirió que los pacientes no hubieran tomado medicamentos activos para el tratamiento de la CUCI, como el ácido 5-aminosalicílico o salzosulfapiridina, una semana antes de comenzar el estudio.

El estudio sigue los principios de la Declaración de Helsinki (1964) y fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Médica de la Facultad de Medicina de Alejandría (Egipto).

Se obtuvieron los consentimientos informados firmados de todos los pacientes, que expresaron su aceptación para participar en el estudio y otorgaron el permiso para la publicación de los resultados.

A todos los pacientes y controles se les hicieron historias médicas completas, además de un examen clínico completo. La CUCI fue diagnosticada con base en exámenes clínicos, radiológicos, endoscópicos e histológicos11. La actividad de la CUCI fue determinada por medio de un compuesto de índices clínicos y endoscópicos (el Índice de Actividad de la Clínico Mayo y el Índice de Gravedad de la Enfermedad), con puntuaciones de 0 a 12 puntos (de actividad nula a la actividad más severa) y subíndices (con la combinación de sangrado rectal, frecuencia de heces y la evaluación global del médico o el subíndice de endoscopia)12.

Se realizó una preparación de laboratorio de rutina, incluido un conteo sanguíneo completo, función hepática (alanina aminotransferasa y aspartato aminotransferasa), albúmina, bilirrubina, HBsAg y HCVAb, glucemia en ayunas y posprandial, colesterol, triglicéridos, nitrógeno ureico en sangre, creatinina, velocidad de sedimentación globular, PCR, calprotectina fecal y pANCA.

En todos los pacientes se realizó colonoscopia. La preparación intestinal consistió en una dieta baja en fibra el día anterior a la colonoscopia y una dosis dividida de 4 L de solución de polietilenglicol (o una sola dosis en caso de colonoscopia realizada por la tarde), no más de 4h antes de la colonoscopia. Se obtuvieron 4especímenes de biopsia de 5sitios, incluidos el íleon y el recto, tanto de mucosa afectada como de mucosa aparentemente normal; los especímenes de diferentes locaciones fueron etiquetados y manejados por separado.

El espécimen de biopsia fue examinado histopatológicamente.

Las muestras frescas de heces fueron recolectadas de casos y controles y almacenadas en alícuotas a –80° para su procesamiento.

El ADN fue extraído de muestras de heces de 180-220mg utilizando el QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Alemania), según las instrucciones del fabricante. Los extractos de ADN fueron almacenados a –80°C hasta la realización de las pruebas PCR. Dos μl de extracto de ADN fueron utilizados en la reacción PCR.

Se ejecutó el protocolo de PCR en tiempo real, de la manera descrita por Tomova et al. (2015)13. Se utilizaron cebadores específicos para PCR dirigidos a filos, géneros o especies seleccionados constituyentes de la microbiota intestinal (Bacteroides, Prevotella, Ruminococcus, Bacteroidetes, Firmicutes, Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridioides difficile, A. muciniphila y F. prausnitzii), además de un cebador de gama amplia dirigido a las secuencias ARNr 16S conservadas de todas las bacterias, cuya amplificación sirvió como denominador contra el cual se estimó la amplificación de otras bacterias.

La amplificación se hizo en un ciclador PCR en tiempo real, el Rotor-Gene Q (Qiagen, Alemania) utilizando un kit SensiFASTTM SYBR® No-ROX PCR (Bioline Co., Reino Unido). Se utilizaron volúmenes de reacción de 20μl, con 4 pmol de cada cebador. La reacción consistió de una desnaturalización inicial a 95°C por 10min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C por 30 s, recociendo a 30°C por 30 s y extensión a 72°C por 30 s. El análisis de la curva de fusión sirvió para revisar la especificidad de los productos amplificados. La cuantificación del ADN bacteriano específico fue expresada como cuantificación relativa (el umbral de ciclo [Ct] en el cual se detectó el ADN para un objetivo específico, relativo al Ct en el cual se detectó el ADN bacteriano universal). La cuantificación relativa fue calculada automáticamente por el programa Rotor Gene y expresada como expresión relativa13.

Se determinó el enterotipo de todos los participantes, según el tipo dominante presente en cada una de las 3bacterias: Bacteroides (enterotipo 1), Prevotella (enterotipo 2) o Ruminococcus (enterotipo 3).

Los datos fueron ingresados en la computadora y fueron analizados utilizando el paquete IBM SPSS versión 20.0 (Armonk, NY: IBM Corp., EE.?UU.). La información cualitativa fue descrita utilizando números y porcentajes, y se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para verificar la normalidad de la distribución. La información cuantitativa fue descrita utilizando rango (mínimo y máximo), media, desviación estándar, mediana y rango intercuartílico (RIQ). La significación de los resultados se hizo al 5%.

Para comparar los diferentes grupos, se utilizó la prueba de chi cuadrada para las variables categóricas. Para los 2grupos de estudio, las variables cuantitativas distribuidas de manera normal se compararon utilizando la prueba t de Student y las variables cuantitativas no distribuidas de manera normal fueron comparadas utilizando la prueba U de Mann-Whitney. Para comparar más de 2grupos de estudio, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para las variables cuantitativas distribuidas de manera anormal. Con el coeficiente de Pearson se correlacionaron 2variables cuantitativas con distribución normal y se utilizó regresión para detectar al factor más independiente que afectó a la Ruminococcus.

Para evaluar el grado de variación de la estructura de la comunidad microbiana dentro de una muestra medimos la diversidad alfa utilizando el índice de diversidad de Shannon14 y para evaluar el grado de similitud entre casos de CUCI y sus pares o controles utilizamos el índice de similitud de Bray-Curtis15.

El presente estudio fue realizado en 21 pacientes con CUCI; 17 de los pacientes eran hombres y 4 mujeres, con una tasa hombre/mujer de 4.3:1. La edad de los pacientes tuvo un rango de 18-43 años, con una media de 28.90?±?6.55 años. El grupo control estuvo compuesto de 20 casos; 11 hombres y 9 mujeres, y su edad tuvo un rango de 20-42 años, con una media de 29.75 ± 5.17 años.

Ninguno de los pacientes presentó historia familiar positiva de CUCI. La duración de la enfermedad tuvo un rango de 1-7 años, con una media de 1.86 ± 1.56 años. El índice de Mayo total tuvo un rango de 4-12, con una media de 9.05 ± 2.38, con 2 casos leves (9.5%), 12 moderados (57.1%) y 7 graves (33.4%). En la tabla 1 se muestran los diferentes puntos del índice de Mayo.

También la calprotectina fecal tuvo un rango de 98-2,810, con una media de 533.95 ± 714.20 y la PCR tuvo un rango de 7-102 con una media de 40.43 ± 34.94. Dieron negativo para pANCA 17/21 pacientes (81%) y 4/21 (19%) dieron positivo.

En todos los pacientes se realizó una colonoscopia convencional. Se encontró una disminución en el patrón vascular normal y eritema leve en 2 pacientes y en 19 se encontró una pérdida completa del patrón vascular y eritema marcado. La friabilidad de la mucosa fue leve en 7 pacientes y severa en 14. Se observó erosión en 12 pacientes y ulceraciones graves y sangrado espontáneo en 7. En 3 pacientes se observó la presencia de pseudopólipos. En la tabla 1 se muestran los hallazgos macroscópicos y microscópicos.

La cuantificación de ADN bacteriano específico no fue expresada como número absoluto sino relativo al ADN bacteriano total presente en la muestra de heces. La media de los valores de la diferencia relativa de la variedad de bacterias fue mostrada en instancias en las que el valor decimal era bajo, como en E-05 (4.75×10-5 se muestra como 4.75E-05).

El análisis bacteriano de filo mostró que los pacientes con CUCI presentaban una disminución estadísticamente significativa en Firmicutes (p <0.001) y aunque Bacteroidetes presentaba disminución, la diferencia no fue estadísticamente significativa al compararla con el grupo control. Además, aunque la relación Firmicutes/Bacteroidetes fue más baja en los casos de CUCI (1.65), al compararla con los controles saludables (2.93) la diferencia no fue estadísticamente significativa (tabla 2) (fig. 1).

Figura 1.

Diagrama de caja y bigotes del microbioma intestinal en los grupos de estudio. La línea gruesa del medio de la caja representa la mediana, la caja representa los rangos intercuartílicos (del percentil 25 al 75), los bigotes representan el mínimo y el máximo.

CUCI: control.

(0.5MB).

Los pacientes con CUCI mostraron una disminución estadísticamente significativa en Ruminococcus, en la comparación con el grupo control (p=0.001), mientras que no existió diferencia estadísticamente significativa entre los pacientes con CUCI y los controles, respecto a Bacteroides y Prevotella (tabla 2) (fig. 1). Tampoco se observó diferencia estadísticamente significativa entre el grupo de CUCI y el grupo control respecto a la relación Prevotella/Bacteroides (tabla 2, fig. 1).

Respecto a las bacterias benéficas, los pacientes con CUCI mostraron una disminución estadísticamente significativa en F. prausnitzii, en comparación con el grupo control (p <0.001). Sin embargo, no se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los pacientes con CUCI y los controles respecto a A. muciniphila, Bifidobacteria y Lactobacilli (tabla 2) (fig. 1).

Para la bacteria patógena Clostridioides difficile, ninguno de los casos controles fue positivo y solamente uno de los casos de CUCI fue positivo, con una abundancia relativa de 2.10E-6.

Respecto a los 3 grupos de gravedad en casos de CUCI, aunque las bacterias benéficas (A. muciniphila, Bifidobacterium, F. prausnitzii, y Firmicutes) fueron más altas en los casos leves que en los casos moderados y graves, la diferencia estadística no fue significativa.

Al estudiar la correlación entre abundancia relativa de los diferentes componentes de la microbiota intestinal y la duración de la enfermedad, no se detectaron correlaciones estadísticamente significativas en el índice de Mayo total, calprotectina fecal y pANCA, excepto por una correlación positiva significativa entre A. muciniphila y calprotectina fecal (r=0.613, p=0.003). También se observó una correlación positiva significativa entre Ruminococcus y calprotectina fecal (r=0.448, p=0.041) y la duración de la enfermedad (r=0.467, p=0.033).

Un análisis de regresión lineal multivariado de los parámetros que afectan al Ruminococcus en los casos de CUCI mostró una correlación estadísticamente significativa entre el índice endoscópico y la calprotectina fecal, mientras que no se observó correlación estadísticamente significativa con la duración de la enfermedad (tabla 3).

El índice de diversidad de Shannon considera tanto la riqueza de especie como la uniformidad y mostró un nivel de diversidad microbiana más bajo en casos de CUCI que en los controles saludables. El valor mediano del índice de diversidad para CUCI fue 1.41 (casos leves=1.24, moderados=1.42, graves=1.44) y fue de 1.48 en los controles saludables. No se observó diferencia estadísticamente significativa entre los casos de CUCI (tabla 4).

Se utilizó el índice de similitud de Bray-Curtis para evaluar la similitud y disimilitud entre los casos de CUCI y los controles saludables. En comparación con los controles saludables, la media de la disimilitud (diferencia) para CUCI fue de 57%, con rango de 20-91%.

Los casos de CUCI leves, moderados y graves mostraron una disimilitud promedio, en relación con los controles saludables, de 41, 60 y 58%, respectivamente. Sin embargo, no se observó una diferencia estadísticamente significativa en gravedad.

Diez (47.6%) de los pacientes con CUCI fueron asignados al enterotipo 1, 10 (47.6%) al enterotipo 2 y solo 1 al enterotipo 3. Por otro lado, 13 (65%) de los casos controles fueron asignados al enterotipo 1, 7 (35%) al enterotipo 2 y ninguno al enterotipo 3. No se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los 2 grupos respecto a la distribución por enterotipo (p=0.436).