Introducción

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) comprende dos entidades clínicas, la colitis ulcerativa crónica idiopática (CUCI) y la enfermedad de Crohn (EC), cuya etiología se desconoce y en las que factores genéticos, ambientales e inmunológicos contribuyen a su patogénesis.1-4

La inflamación es una reacción del organismo en que las células inmunitarias producen una variedad de citocinas que favorecen esta condición.5

En la actualidad se desconoce si lo que ocurre es una respuesta exagerada a la microbiota intestinal con un proceso de hipersensibilidad o si se trata de un proceso de hiposensibilidad que podría actuar como factor desencadenante. Sin duda, ambas condiciones pueden suscitarse, siempre en combinación con el factor ambiental y la predisposición genética. El conocimiento de los mecanismos inmunológicos desencadenados en la EII ha permitido identificar nuevas estrategias terapéuticas mediante el bloqueo directo de citocinas proinflamatorias como la IL-6 y el TNF-a. La CUCI presenta una respuesta inmunitaria anormal en la mucosa intestinal.6 En la CUCI se informa un aumento en la respuesta del sistema inmunitario que conduce a la producción de mediadores inflamatorios como citocinas y moléculas de adhesión que causan destrucción celular.7 Por lo anterior, es importante considerar el papel que pueden tener las citocinas IL-6 y TNF-a en las diferentes situaciones de la enfermedad (como actividad y remisión) con el fin de desarrollar nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos.8

Existen estudios en los que se informan diferencias en la expresión génica de citocinas entre los pacientes con EII y controles.9 Sin embargo, en pocos se analiza la relación entre la expresión génica y la actividad (clínica e histológica) o las diferentes situaciones de la enfermedad (remisión, actividad leve, moderada y grave). En este trabajo se realiza un análisis cuantitativo del ácido ribonucleico mensajero (mRNA) del gen de IL-6 y TNF-a en la mucosa intestinal de pacientes con CUCI y se evalúa su correlación con el grado de actividad histológica para identificar un marcador molecular de inflamación.

Pacientes y métodos

Pacientes

Se estudiaron 36 pacientes con CUCI, 19 con actividad (12 mujeres, edad media 37 ± 2 años) y 17 en remisión (9 mujeres, edad media 40 ± 2 años) que acudieron a la Clínica de Enfermedad Inflamatoria Intestinal del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán. Todos los sujetos del estudio dieron su consentimiento para participar en el estudio. El diagnóstico de CUCI se confirmó por histopatología. La actividad inflamatoria se evaluó en forma clínica y por endoscopia según la puntuación de MAYO y la actividad histológica se estableció usando el sistema de gradiente descrito por Riley.10 Se incluyeron 13 controles sanos (8 mujeres, edad media 40 ± 2 años) que acudieron por pérdida de peso en estudio o que habían cursado con anemia (ya resuelta) sin otras enfermedades asociadas (cáncer, enfermedad autoinmunitaria, colitis medicamentosa, colitis postradiación, colitis infecciosa, colitis isquémica, etc.), sin datos clínicos o endoscópicos de EII y que mostraran una biopsia colónica de características normales. También se incluyó un grupo de 11 pacientes (5 mujeres, edad media 44 ± 2 años), con datos de inflamación (proctitis crónica leve), sin hallazgos histológicos compatibles con EII y sin etiología conocida.

Tejido

Se obtuvo un total de 60 biopsias de mucosa rectal a las cuales se les cuantificó la expresión génica de IL-6 y TNF-a. Para el gradiente de expresión de IL-6, se tomaron biopsias de distintos segmentos del intestino grueso (ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide y recto), como se ilustra en la Tabla 1.

Las biopsias se colocaron en tubos crioviales con 1 mL de preservador de ácidos nucleicos (RNA later®), se mantuvieron a temperatura ambiente por un periodo de 6 a 8 horas, y más tarde fueron almacenadas a -70 ºC hasta el momento de la extracción del RNA.

Extracción del RNA total y reacción de la transcriptasa inversa (RTR)

El RNA total se obtuvo empleando un estuche de extracción (High Pure RNA Tissue Kit de Roche), según la metodología sugerida por el fabricante. Las biopsias se mezclaron en un homogeneizador durante 1 minuto con amortiguador de lisis, la mezcla se lavó con etanol al 100%, empleando las columnas de purificación, se centrifugó a 13 000 xg durante 15 segundos, se lavó con amortiguador a 13 000 xg durante 15 segundos, y para finalizar se agregó 100 µL de amortiguador de elución para diluir el RNA total.

La síntesis de DNA de cadena complementaria se realizó mediante la RTR en tiempo real. La reacción se llevó a cabo con 20 µL de la siguiente forma: preincubación, 25 °C x 10 minutos; incubación, 55 °C x 30 minutos, seguida de la desnaturalización, 85 °C x 5 minutos en un termociclador (Perkin-Elmer 9600 Co. Norwalk, CT).

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-TR)

La reacción en cadena de la polimerasa se realizó empleando como sustrato el DNA complementario que resultó de la retrotranscripción. Para la amplificación de las regiones de interés, la reacción se llevó a cabo en 10 µL. Para determinar la expresión relativa de los genes de IL-6, TNF-a y RPLP0 (ribonucleoproteína larga humana P0, como gen de referencia), se utilizó el termociclador Light Cycler 2.0 Roche® e iniciadores sentido y antisentido de Amplio byosystem® y sondas Taq Man para cada gen (Universal Probe Library Set, Human de Roche®), como se ilustra en la Tabla 2.

La amplificación se realizó bajo las siguientes condiciones: un programa de desnaturalización a 95 °C durante 10 minutos, 45 ciclos de amplificación (95 °C-10 segundos, alineación 60 °C 10 segundos, extensión 40 °C-30 segundos) y un ciclo de enfriamiento a 40 °C durante 30 segundos.

Análisis estadístico

La comparación de los datos de grupos independientes se analizó mediante la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis. Para determinar la correlación entre la expresión del gen de IL-6 con la actividad histológica como marcador de inflamación se utilizó la prueba de correlación de Spearman. Se tomó como significativo un valor de p < 0.05. El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico SPSS versión 15.0.

Resultados

Se incluyeron 60 individuos en el análisis final, de los cuales 17 tenían CUCI en remisión, 19 CUCI activa y 24 fueron del grupo control. Las características clínicas y demográficas se muestran en la Tabla 3.

Expresión del gen IL-6 y TNF-a

La expresión de IL-6 se encontró significativamente más elevada en los pacientes con CUCI activa en comparación con los enfermos con CUCI en remisión (p = 0.004) y con los controles sanos (p = 0.001). No se encontró diferencia significativa entre los pacientes con CUCI activa y los controles con inflamación (p = 0.446). La expresión del gen de TNF-a fue mayor en las biopsias rectales de pacientes con CUCI activo que en sujetos controles (p = 0.004) o en remisión (p = 0.007). No se observó diferencia significativa entre individuos controles sanos y los pacientes con CUCI en remisión (p = 0.196) (Figuras 1 y 2).

Figura 1. Expresión de IL-6 en mucosa de recto

Figura 2. Expresión de IL-6 en intestino

Gradiente de expresión de IL-6 en el intestino

El patrón de expresión del gen de IL-6 en los pacientes con CUCI activa y pancolitis fue mayor en las biopsias de colon sigmoide y recto respecto a los pacientes en remisión. En los sujetos control la expresión estuvo disminuida y fue homogénea en todas las regiones del intestino (Figura 3).

Figura 3. Expresión de TNF-a en mucosa de recto

Expresión del gen de IL-6 y su correlación con la actividad histológica

La correlación fue significativa entre la expresión del gen de IL-6 y la actividad histológica (p = 0.002) (Figura 4).

Figura 4. Correlación de la expresión de IL-6 con la actividad histológica

Asociación de la expresión de IL-6 y las características clínicas

Los pacientes con mayores grados de expresión del gen de IL-6 tenían una evolución de la enfermedad de más de 3 años (p = 0.016). La respuesta al tratamiento médico y el curso clínico no mostraron diferencia significativa (p = 0.844 y p = 0.680, respectivamente). No se encontraron diferencias entre la expresión de IL-6 en variables clínicas como extensión de la enfermedad, género, edad al momento del diagnóstico y manifestaciones extraintestinales (Tabla 4).

Discusión

En el presente trabajo se cuantificó la expresión del gen de IL-6 y de TNF-a en la mucosa rectal de pacientes con CUCI activa, en remisión y en un grupo control. Los hallazgos obtenidos de la expresión del gen de IL-6 en los diferentes grupos de estudio mostraron que la expresión en biopsias de recto en pacientes con CUCI activa estaba aumentada en comparación con CUCI en remisión y controles sanos. Los niveles de expresión del gen de IL-6 y de TNF-a disminuyeron en pacientes con CUCI en remisión comparados con el grupo control. Determinar la expresión de la IL-6 y correlacionarla con la actividad histológica permitió confirmar los hallazgos histopatológicos para seleccionar de manera adecuada los grupos de estudio (CUCI activa o en remisión) y sirvió para confirmar que la IL-6 es un buen marcador molecular de inflamación y en consecuencia de actividad. Existen diferencias en la expresión de esta interleucina entre sujetos con CUCI activa e inactiva, los del grupo control sano y los del grupo control con inflamación. Su expresión aumenta de manera sustancial en los pacientes con CUCI activa comparados con los del grupo control inflamado y esto se debe a que la expresión no es similar en cualquier proceso inflamatorio.

Estos hallazgos confirman los resultados obtenidos por Raddatz y colaboradoress9 quienes encontraron mayor expresión de IL-6 en recto y sigmoide de pacientes con CUCI activa con respecto a los pacientes en remisión.

Cantor y colaboradores encontraron que el polimorfismo (-174G/C) del gen IL-6 afecta la actividad y expresión del mRNA y por lo tanto de la proteína. El polimorfismo (-174G/C) del gen de IL-6 se relacionó con el desarrollo de EII.11 Sawa y colaboradores12 determinaron mediante la técnica de PCR en tiempo real un aumento significativo en la expresión de los niveles de mRNA del gen de TNF-a en biopsias de intestino en condiciones de inflamación aguda de sujetos con CUCI con respecto a los sujetos control. Los niveles de mRNA de las citocinas de Th1 y de Th2 están incrementados en la mucosa colónica de pacientes con CUCI, lo que sugiere la posibilidad del papel fundamental que desempeñarían la inmunidad celular y la humoral en la patogénesis de la CUCI.12

Hasta el momento no se han realizado estudios que asocien los grados de expresión de IL-6 y TNF-a con características clínicas de la CUCI. En este trabajo se observó que los pacientes con CUCI con mayores niveles de expresión de IL-6 fueron los que presentaban mayor grado de actividad histológica (p = 0.002).

No se observaron diferencias significativas en los niveles de expresión del gen de IL-6 y TNF-a en variables como el género ya que los valores de expresión de ambos genes son similares en hombres y en mujeres. En relación con otra variable como la extensión de la CUCI, se demostró que la expresión de IL-6 difiere en las distintas regiones del colon en los pacientes con esa afección, ya que en personas normales se comprobó una expresión homogénea a lo largo de todos los segmentos del colon. Esta posible diferencia de expresión en las distintas regiones del colon puede marcar la diferencia para que algunos pacientes desarrollen pancolitis y otros CUCI distal. En relación con las manifestaciones extraintestinales, tampoco se encontró asociación con los grados de expresión de IL-6 y TNF-a, lo que indicaría que los niveles de expresión de ambas citocinas en el recto se relacionan con el desarrollo de la CUCI, pero tal vez no guardan ninguna relación con complicaciones que la CUCI produce en otros órganos.

Lo anterior explicaría que los niveles de expresión de IL-6 se encuentran aumentados en pacientes con CUCI en remisión en comparación con el grupo control y confirmaría el aumento de la expresión de IL-6 como factor de riesgo para mantener una CUCI activa.

Este tipo de estudios básicos permite identificar marcadores bioquímicos de inflamación y establecer diferentes grupos de estudio, además de apoyar su po sible aplicación en la clínica y su uso potencial en la administración de terapias biológicas. Un mayor conocimiento de los mediadores implicados en la inflamación intestinal ha abierto nuevas líneas de investigación basadas en la manipulación de la respuesta inmunitaria con fines terapéuticos, como son la neutralización de citocinas proinflamatorias como el TNF-a. El infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico murino-humano contra el TNF-a que se desarrolló como agente terapéutico frente a las enfermedades mediadas por el TNF-a. El tocilizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une al receptor de la interleucina 6 (IL-6) y bloquea así la actividad de esta citocina, una proteína con una función importante en el proceso inflamatorio; en un ensayo clínico de fase II muestra buena tolerancia al tratamiento y mejora los síntomas durante la fase aguda de la inflamación.

En conclusión, la expresión del gen de IL-6 es un buen marcador molecular de inflamación comparada con la expresión de TNF-a ya que se encontró una correlación significativa de la expresión de IL-6 con el grado actividad histológica.

Correspondencia: Dra. Gabriela Columba Fonseca Camarillo,

Laboratorio del Departamento de Gastroenterología, Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán.

Vasco de Quiroga No. 15, Delegación Tlalpan. México, DF, CP. 14000.

Correo electrónico: gabrielafaster@gmail.com